# 導(dǎo) 讀 #
　　采用加標(biāo)比對試驗(yàn)探索培養(yǎng)溫度和時(shí)間對酶底物法檢測飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的影響；在確定*適培養(yǎng)條件后，采集飲用水水樣進(jìn)行檢測并通過16S rDNA序列GenBank比對試驗(yàn)對陽性結(jié)果進(jìn)行確證。結(jié)果表明，酶底物法檢測飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的*適培養(yǎng)條件為39 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，嗜肺軍團(tuán)菌檢出濃度與理論濃度基本一致，加標(biāo)回收率范圍為98.4%~108.8%；對北方城市部分飲用水水樣進(jìn)行嗜肺軍團(tuán)菌檢測，檢測發(fā)現(xiàn)陽性水樣4份，經(jīng)乳膠凝集血清分型試驗(yàn)和16S rDNA序列分析確認(rèn)均為嗜肺軍團(tuán)菌。

　0 引言
　　軍團(tuán)菌（Legionella）是一種常見的水源性致病微生物，廣泛存在于各種水環(huán)境中，特別是在包括飲用水在內(nèi)的人工水體中。目前空調(diào)冷卻水、噴泉水等非飲用水中軍團(tuán)菌污染問題已引起各國研究者的廣泛關(guān)注，而飲用水中軍團(tuán)菌污染的相關(guān)研究較少。但近年來飲用水系統(tǒng)被軍團(tuán)菌污染事件時(shí)有發(fā)生，特別是2020年受新冠疫情的影響，多數(shù)建筑長期封閉導(dǎo)致供水系統(tǒng)長時(shí)間水流停滯，為軍團(tuán)菌的生長繁殖提供有利條件。2020年5至7月美國有報(bào)道稱，包括美國疾控中心多處辦公樓在內(nèi)的供水系統(tǒng)、度假酒店的自來水以及大學(xué)校園的建筑供水均檢出軍團(tuán)菌。感染軍團(tuán)菌可引起嚴(yán)重的呼吸道傳染病，其中嗜肺軍團(tuán)菌（Legionella pneumophila，LP)與人類疾病關(guān)系*為密切。目前我國現(xiàn)行《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5749-2006）未對軍團(tuán)菌指標(biāo)提出控制要求，現(xiàn)有的微生物指標(biāo)也無法正確提示軍團(tuán)菌污染水平。但美國環(huán)保署（US-EPA）2001年頒布的《國家飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》（EPA 816-F-09-004）中國家一級飲用水規(guī)程規(guī)定軍團(tuán)菌*大污染水平的控制目標(biāo)為零。世界衛(wèi)生組織（WHO）2011年發(fā)布的《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》第四版也已將軍團(tuán)菌列入12種水源性病原體之一，明確其衛(wèi)生學(xué)意義重大。
　　分離培養(yǎng)法是目前國際通用檢測軍團(tuán)菌的“專用標(biāo)準(zhǔn)”，適用于各種環(huán)境水體。但也有研究者提出該方法存在操作繁瑣，檢測周期較長，易受雜菌干擾等缺陷。近些年出現(xiàn)了多種新的嗜肺軍團(tuán)菌定量檢測方法。其中，酶底物法作為一種同時(shí)適用于飲用水和非飲用水的嗜肺軍團(tuán)菌檢測方法備受關(guān)注。北美、歐洲、日本等國家相繼對該方法進(jìn)行了能力驗(yàn)證及應(yīng)用，普遍認(rèn)為酶底物法具有操作簡單、靈敏性高的特點(diǎn)，可用于檢測飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌。目前，我國還未對該方法在檢測飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的可行性進(jìn)行研究?；诖耍狙芯繑M通過加標(biāo)試驗(yàn)對酶底物法檢測飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌*適宜的培養(yǎng)條件進(jìn)行探索，并運(yùn)用該方法對飲用水水樣進(jìn)行檢測分析，為進(jìn)一步探索適用于飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢測方法提供參考依據(jù)。

　1 材料與方法
　　1.1 試驗(yàn)用菌種
　　試驗(yàn)所用的嗜肺軍團(tuán)菌質(zhì)控樣品NCTC 11192（ATCC 33152）購置于美國愛德士生物科技公司（IDEXX），單只質(zhì)控樣真值為1 604±335 MPN/100mL。
　　1.2 儀器和試劑
　　程控定量封口機(jī)（IDEXX），恒溫培養(yǎng)箱，渦旋振蕩器，生物安全柜，離心機(jī)，水浴鍋，移液槍；酶底物培養(yǎng)基、定量盤（IDEXX），乳膠凝集試劑盒（OXOID），軍團(tuán)菌診斷血清試劑1-15型（天津生物芯片），BCYE和BCYECYE培養(yǎng)基（陸橋），QIAamp DNA Mini Kit試劑盒（QIAGEN）。
　　1.3 培養(yǎng)條件
　　1.3.1 方法原理
　　酶底物法是一種以細(xì)菌酶檢測技術(shù)為基礎(chǔ)，基于*可能數(shù)（most probable number, MPN）方法的定量檢測方法。嗜肺軍團(tuán)菌利用酶底物試劑中豐富的氨基酸、維生素和其他營養(yǎng)成分迅速生長繁殖，同時(shí)會利用額外添加的酶底物反應(yīng)生成一種棕色的指示物使溶液顯褐色或者渾濁。
　　1.3.2 培養(yǎng)條件設(shè)置
　　本研究擬對培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行考察。根據(jù)分離培養(yǎng)法中軍團(tuán)菌*適培養(yǎng)溫度為36±1℃以及酶底物法中建議的飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌培養(yǎng)溫度為39℃，本研究將培養(yǎng)溫度設(shè)定為5組：33℃、36℃、39℃、42℃、45℃，每個(gè)溫度條件設(shè)9個(gè)平行樣，并在培養(yǎng)箱中放入一個(gè)裝有足量水的托盤，以保持培養(yǎng)箱中濕度適宜。培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為11 d，樣品在培養(yǎng)過程中每隔24h觀察記錄96孔定量盤的顏色和濁度變化，從第1 d到第11 d持續(xù)觀察。
　　1.3.3 培養(yǎng)方法
　　嗜肺軍團(tuán)菌質(zhì)控樣品用適量無菌去離子水稀釋，配制成高、中、低（321±67 MPN/100mL、64±13 MPN/100mL、8±2 MPN/100mL）三種不同濃度的100mL菌懸液作為陽性待測樣品。在待測樣品中加入酶底物培養(yǎng)基，振蕩混勻并倒入96孔定量盤中，輕拍定量盤排出空氣后放入程控定量封口機(jī)中封口，*后將定量盤紙片一面朝下，在33℃、36℃、39℃、42℃、45℃溫度條件下培養(yǎng)。同時(shí)，用無菌水代替陽性待測樣品，其他操作步驟同上述一致，設(shè)為陰性對照。
　　1.3.4 結(jié)果判讀
　　相對陰性對照而言，無論渾濁與否，任何顯褐色的跡象均認(rèn)為嗜肺軍團(tuán)菌陽性；相對陰性對照而言，無論是否顯褐色，濁度大于陰性對照即認(rèn)為嗜肺軍團(tuán)菌陽性；如顏色與濁度方面與陰性對照無差異，認(rèn)為嗜肺軍團(tuán)菌陰性。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果，數(shù)出顯陽性的大小孔格數(shù)，對照MPN表得到嗜肺軍團(tuán)菌濃度（MPN/100mL）。
　　1.4 飲用水水樣檢測
　　1.4.1 水樣的采集和檢測
　?。?）采集水樣：于2020年6月隨機(jī)無菌采集北方某城市飲用水水樣，每份樣品100mL。水樣低溫運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室后室溫儲存，3 d內(nèi)進(jìn)行酶底物法檢測。
　?。?）培養(yǎng)方法：用水硬度測試條測定水樣的硬度。根據(jù)水的硬度進(jìn)行預(yù)處理：0~2個(gè)顯色條呈陽性為低硬度，需向100mL水樣中加入酶底物補(bǔ)充劑0.33mL，3~4個(gè)顯色條呈陽性為高硬度，需向100mL水樣中加入酶底物補(bǔ)充劑1mL。加入酶底物培養(yǎng)基到混合液中，振蕩混勻，倒盤封口。按照條件探索試驗(yàn)確定的*適培養(yǎng)條件培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置陰性對照。結(jié)果判讀同1.3.4。
　　1.4.2 陽性孔確證試驗(yàn)
　　本研究同時(shí)采用血清凝集和16S rDNA測序兩種方法對陽性結(jié)果進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。
　?。?）血清凝集法：用接種環(huán)取10 μL陽性菌懸液涂布于BCYE和BCYE-CYE培養(yǎng)基上，在CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)2~4 d。對在BCYE上生長、BCYE-CYE上無生長的菌落進(jìn)行血清凝集型別鑒定，可分出血清1-15型。
　　（2）16S rDNA序列分析：DNA提取步驟按照QIAamp DNA Mini Kit試劑盒說明書進(jìn)行；16S rDNA引物信息：引物F為5′-GTTAAGTCCCGCAACGA-3′；引物R為5′-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3′，由某基因科技有限公司合成。PCR體系：1 μL模板，15 μL Super Mix，1 μL Primer F（10p），1 μL Primer R（10p），12 μL ddH2O，共30 μL。反應(yīng)程序：96℃預(yù)變形5min；96℃變性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；*后，72℃延伸10min。擴(kuò)增后取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測并觀察條帶性狀；PCR產(chǎn)物純化按照磁珠純化標(biāo)準(zhǔn)操作流程操作；純化后的PCR產(chǎn)物由某基因科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測序分析。
　　1.5 質(zhì)量控制
　　ATCC 33152為本次研究陽性對照質(zhì)控菌株。
　　1.6 統(tǒng)計(jì)分析
　　數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。嗜肺軍團(tuán)菌加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果的比較采用單因素方差分析。
　　2 結(jié)果
　　2.1 培養(yǎng)條件
　　2.1.1 培養(yǎng)溫度
　　加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)溫度為33℃時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌加標(biāo)回收率在21.3%~75%；當(dāng)培養(yǎng)溫度為36℃時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度接近加標(biāo)濃度，加標(biāo)回收率在89.5%~105%；當(dāng)培養(yǎng)溫度為39℃時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度與加標(biāo)濃度基本一致，加標(biāo)回收率在98.4%~108.8%；當(dāng)培養(yǎng)溫度為42℃時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度偏低，加標(biāo)回收率在25.8%~51.4%；當(dāng)培養(yǎng)溫度為45℃時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度明顯偏低，加標(biāo)回收率<34.6%。采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示F=17.90，p<0.05，認(rèn)為5組數(shù)據(jù)有顯著性差異，具體數(shù)據(jù)見表1。單因素方差分析兩兩比較結(jié)果顯示，39℃組與36℃組數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.576）。

　　表1 不同培養(yǎng)溫度嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度（MPN/100mL）和加標(biāo)回收率（%）

注:經(jīng)單因素方差分析，p<0.05;

2.1.2 培養(yǎng)時(shí)間
　　由圖1a可知，嗜肺軍團(tuán)菌陽性樣品在高濃度時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為45℃、42 ℃、39 ℃、36 ℃時(shí)，第4 d開始出現(xiàn)陽性現(xiàn)象，45℃、42 ℃、39 ℃ 時(shí)第7 d結(jié)果趨于穩(wěn)定，36 ℃條件下第8 d結(jié)果趨于穩(wěn)定；當(dāng)培養(yǎng)溫度為33℃時(shí)，第6 d開始觀察到陽性現(xiàn)象，直到第11 d未觀察到連續(xù)穩(wěn)定結(jié)果即未達(dá)到*大檢出濃度。由圖1b可知，嗜肺軍團(tuán)菌陽性樣品在中濃度，培養(yǎng)溫度為42 ℃、39℃、36 ℃時(shí)，第4 d開始觀察到陽性現(xiàn)象，并分別在第6 d、第7 d、第9 d結(jié)果趨于穩(wěn)定；當(dāng)培養(yǎng)溫度為45℃、33℃時(shí)，第5 d開始觀察到陽性現(xiàn)象，并分別在第6 d和第10 d結(jié)果趨于穩(wěn)定。由圖1c可知，嗜肺軍團(tuán)菌陽性樣品在低濃度，培養(yǎng)溫度為45℃ 時(shí)，未觀察到陽性現(xiàn)象，分析可能是溫度過高導(dǎo)致嗜肺軍團(tuán)菌死亡或者活性消失；當(dāng)培養(yǎng)溫度為42℃時(shí)，在第5 d出現(xiàn)陽性現(xiàn)象，第6 d結(jié)果趨于穩(wěn)定；當(dāng)培養(yǎng)溫度為39℃、36℃時(shí)，第4 d開始觀察到陽性現(xiàn)象，分別在第6 d和第9 d結(jié)果趨于穩(wěn)定；當(dāng)培養(yǎng)溫度為33℃時(shí)，在第6 d觀察到陽性現(xiàn)象，第10 d結(jié)果趨于穩(wěn)定。

圖1 不同濃度嗜肺軍團(tuán)菌隨時(shí)間變化生長曲線

　2.2 飲用水水樣檢測
　　本研究采用酶底物法對采集的飲用水水樣進(jìn)行了嗜肺軍團(tuán)菌檢測，共檢出嗜肺軍團(tuán)菌陽性樣品4份，分離獲得4株嗜肺軍團(tuán)菌，通過乳膠凝集血清學(xué)分型分別為1型、15型、7型、10型嗜肺軍團(tuán)菌；另外通過16S rDNA測序分析對其進(jìn)行菌株確證，結(jié)果顯示，分離的4株菌均屬嗜肺軍團(tuán)菌，表現(xiàn)為2種基因型，命名為Lp-1和Lp-NO.2。其中Lp-1有2株，對應(yīng)的血清型為1型和7型；Lp-NO.2有2株，對應(yīng)的血清型為10型和15型。根據(jù)Blast結(jié)果顯示，Lp-1株與CP048618.1 Legionella pneumophila親緣關(guān)系*近，相似性為1；Lp-NO.2與LR134380.1 Legionella pneumophila subsp. pascullei親緣關(guān)系*近，相似性為9977%?，F(xiàn)基于16S rDNA測序結(jié)果建立的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 基于16S rDNA測序結(jié)果的嗜肺軍團(tuán)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論
　　3.1 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間
　　培養(yǎng)溫度是影響嗜肺軍團(tuán)菌生長繁殖的重要因素，一般認(rèn)為軍團(tuán)菌可在20~50℃的水溫環(huán)境下生存，*佳生存溫度為25~42 ℃。研究表明，當(dāng)酶底物法培養(yǎng)溫度高至42℃以上或低至33℃以下時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度均明顯低于理論濃度的50%，即加標(biāo)回收率均低于50%，說明高溫可以殺滅嗜肺軍團(tuán)菌或使其活性喪失，而溫度過低又會導(dǎo)致嗜肺軍團(tuán)菌活性降低，使顯色反應(yīng)延遲或不發(fā)生。本研究中，當(dāng)培養(yǎng)溫度為39℃和36℃時(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度值與理論濃度值基本一致，即均可達(dá)到較高的加標(biāo)回收率，為較適宜的培養(yǎng)溫度，且從圖2的指數(shù)增長曲線可以看出39℃時(shí)嗜肺軍團(tuán)菌*大檢出濃度比36℃時(shí)更接近理論濃度值，但未發(fā)現(xiàn)兩者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　培養(yǎng)時(shí)間對酶底物法具有顯著的影響。相同溫度條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，嗜肺軍團(tuán)菌檢出率增高。當(dāng)溫度≥39℃時(shí)指數(shù)增長階段集中在第4~7 d，當(dāng)溫度＜39℃時(shí)指數(shù)增長階段集中在第4~10 d。結(jié)合培養(yǎng)溫度的研究結(jié)果，重點(diǎn)比較39℃和36℃培養(yǎng)溫度下嗜肺軍團(tuán)菌的生長趨勢。結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)溫度為39℃時(shí)，高中低濃度陽性樣品均能穩(wěn)定在第4 d開始出現(xiàn)陽性顯色現(xiàn)象，并在第6 d或第7 d達(dá)到*大檢出濃度；當(dāng)培養(yǎng)溫度為36℃時(shí)，高中低濃度陽性樣品均在第4 d開始出現(xiàn)陽性顯色現(xiàn)象，并在第8 d或第9 d達(dá)到*大檢出濃度。綜合考慮培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間，在保持高回收率的同時(shí)盡可能縮短培養(yǎng)周期，本研究認(rèn)為酶底物法在39℃條件下，選擇7 d作為培養(yǎng)時(shí)間，嗜肺軍團(tuán)菌的檢出效果*好。
　　3.2 方法的特異性
　　本研究通過酶底物法對北方某城市的部分飲用水水樣進(jìn)行檢測，共檢出嗜肺軍團(tuán)菌陽性4份，通過血清分型試驗(yàn)和16S rDNA序列分析對陽性樣品進(jìn)行確證，兩種確證方法結(jié)果一致，4份陽性樣品均為嗜肺軍團(tuán)菌。結(jié)果表明，本研究通過酶底物法檢測獲得的4份嗜肺軍團(tuán)菌陽性水樣特異性為1，這與Spies K等人的研究結(jié)果相同。
　　4 結(jié)論
　　嗜肺軍團(tuán)菌是飲用水中存在的潛在條件致病病原體。隨著城市化發(fā)展進(jìn)程加快，嗜肺軍團(tuán)菌在飲用水系統(tǒng)中滋生并傳播的風(fēng)險(xiǎn)日益增大。因此加強(qiáng)對飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的檢測和控制對保障用水安全至關(guān)重要。通過試驗(yàn)證明，酶底物法檢測飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌的*適宜培養(yǎng)條件為39℃恒溫培養(yǎng)7 d。在適宜條件下，酶底物法檢測飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌具有良好的穩(wěn)定性和特異性，并具有操作簡單、結(jié)果易于判讀等特點(diǎn)，在檢測飲用水中嗜肺軍團(tuán)菌領(lǐng)域具有良好的發(fā)展和應(yīng)用前景。